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DC 細胞的制備方法

時間:2015-12-10 作者:市場部 文章來源: 瀏覽:20333

           DC“Dendritic Cells”的縮寫,中文全稱為“樹突狀細胞”,因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC 是由2011 年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學家Ralph M. Steinman 于1973 年發現的,是目前發現的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實,DC 是唯一能夠顯著刺激初始T 細胞(Na?ve T cells)增殖的APC,而其它種類的APC(如單核巨噬細胞,B 細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T 細胞,因此DC 是機體適應性T 細胞免疫應答的始動者,在腫瘤免疫中發揮著極其重要的作用。



【培養原理】

因為 DC 需從其它種類細胞誘導分化而來,且可分為不同的成熟階段,所以通常分為2個步驟進行培養:

Step 1:從DC 的祖細胞(如單核細胞)誘導分化為未成熟DC (immature DC,iDC);

Step 2:從iDC 誘導分化為成熟DC (mature DC,mDC)。


Step 1 需要試劑

GM-CSF 和IL-4 共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC,此時的DC 具有較強的抗原攝取和加工能力,但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I 類、II 類分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等),但不表達或低表達CD14。


GM-CSF(粒細胞巨噬細胞集落刺激因子)

GM-CSF 是最早被鑒定出對DC 培養有作用的細胞因子之一,在DC 培養中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化,細胞表面MHC II 類分子的表達得以提高,從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外,GM-CSF 也可促進DC 的存活。

IL-4 (白細胞介素-4)

IL-4 在由單核細胞誘導成DC 的過程中發揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長,從而引導單核細胞向DC 方向分化。若培養體系中不加IL-4,單核細胞將分化為巨噬細胞。同時,IL-4 還有降低細胞表面表達CD14 分子的能力。CD14 表達水平的降低是單核細胞分化為DC 的重要標志。


Step 2 需要試劑

TNF-a/IL-1b/ IL-6 (腫瘤壞死因子-a/白細胞介素-1b/白細胞介素-6)

TNF-a,IL-1b和IL-6 均為促炎癥因子,在感染局部和腫瘤部位被誘導產生。體外研究表明,這3 種細胞因子均可下調未成熟DC 的巨胞飲作用和表面Fc 受體的表達,使細胞內MHC II 類分子區室(class II compartment)消失,但能夠上調細胞表面MHC I 類、II 類分子和B7 家族分子(CD80, CD86 等)的表達, 使未成熟DC 分化為成熟DC,此時DC 的抗原攝取和加工能力明顯減弱,而抗原遞呈能力顯著增強,可極強地激活T細胞。TNF-a/IL-1b/IL-6 三因子組合可在無牛血清培養條件下誘導DC 的完全成熟,從而制備出可以應用于臨床的DC。


PGE2 (prostaglandin E2,前列腺素E2)

PGE2 也是炎性介質,可由TNF-a,IL-1 和LPS(脂多糖)等炎癥信號誘導產生。在TNF-a/IL-1b/IL-6 成熟誘導組合中添加PGE2,可進一步提高DC 的產量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力。這里尤為重要的是DC 遷移能力的提高。因為TNF-a/IL-1b/IL-6 誘導成熟的DC 遷移能力較弱,不能很好地到達淋巴結而激活T 細胞。而添加PGE2 后誘導成熟的DC 因表面趨化因子受體的高表達,而更容易遷移至淋巴結,而引起機體對抗腫瘤的免疫反應。因此,TNF-a/IL-1b/IL-6/PGE2 組合(見下表)廣泛應用于臨床,并被認為是制備成熟DC 的“金標準”

組份 的工作濃度

TNF-a  10ng/ml   IL-1b    10ng/ml   IL-6   1000 U/ml   PGE2  1mg/ml


DC 制備步驟

1. 外周血單個核細胞的采集

1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80 - 100ml;

1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC);

1.3 無血清培養液洗滌2 次,獲得純度在90%以上的PBMC,細胞數量需達到1-3 x 108。


2. (可選步驟) 腫瘤抗原的制備

  用于負載DC 的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA),也可以是腫瘤全細胞抗原。用 TSA 或TAA 負載的DC 具有很好的靶向性,但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全細胞抗原負載DC 可克服這些缺陷,因為此時無需知道哪些抗原是腫瘤細胞的TSA 或TAA,而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC 可誘導產生針對不同抗原決定簇的細胞毒T 淋巴細胞(CTL)克隆,從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷。腫瘤細胞全抗原負載DC 的方法很多,包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC,用腫瘤活細胞負載DC,和將腫瘤

細胞與DC 融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC,因該方法簡單、快速、有效。反復凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法,具體步驟如下:

2.1 手術切除腫瘤標本,無菌條件下,將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈;

2.2 無菌生理鹽水洗3 次;

2.3 用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎,加入RPMI 1640 培養基,充分研磨;

2.4 200 目無菌網過濾后收集單細胞懸液;

2.5 用 RPMI 1640 培養基重懸細胞至1-2 x 107/ml,裝入5ml 無菌凍存管中;

2.6 將凍存管浸入液氮中速凍,10 min 后取出,再迅速放入37oC 水浴中解凍10 min。反復3-5 次;

注:也可以-80/37℃反復凍融3-5 次。

2.7 將腫瘤裂解物加入離心管中,3000rpm,離心10min;

2.8 收集上清,0.22mm 濾膜過濾除菌,留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體;

2.9 -80℃ 保存備用。


3. DC 細胞的培養及鑒定

3.1 步驟 1 中獲得的PBMC 用無血清培養液調整細胞濃度至2 x 106/ml,置于培養瓶內;

3.2 37℃,5% CO2 培養箱中孵育2h,以使單核細胞貼壁;

3.3 洗去懸浮細胞,在貼壁細胞中加入含重組人GM-CSF(500-1,000U/ml)和重組人IL-4(500U/ml)的無血清培養液,37℃,5% CO2 培養箱中培養,誘導單核細胞向DC 細胞分化;

3.4 每 2-3d 半量換液一次,并補足細胞因子;

3.5 (可選步驟) 在培養的第5d, 加入步驟2 中獲得的腫瘤抗原50 mg/ml,對DC 進行抗原負載;

注:若不對DC 進行抗原負載,該步省略。

3.6 在培養的第6d,加入重組人TNF-a(10ng/ml),IL-1b(10ng/ml),IL-6(1000U/ml)和PGE2(1mg/ml),誘導DC 細胞成熟;

3.7 在培養的第7d 或第8d,收獲DC 細胞,其數量應達到1×106 個以上;

3.8 DC 的質檢:

3.8.1 活細胞比例:臺盼藍染色驗證活細胞應在90%以上;

3.8.2 形態學觀察:>90%細胞半懸浮,細胞有多個樹突樣突起;

3.8.3 細胞表型分析(見下圖):流式細胞術檢測DC 細胞表面CD14、HLA-DR、CD40、CD80、CD83 和CD86 等分子的表達,成熟的DC 不表達CD14,而高表達其他分子。CD83 是成熟DC 的特異性標志,在單核細胞和不成熟DC 表面不表達或低表達。

3.8.4 無菌檢測:收獲細胞前取少量培養物進行細菌、真菌培養,并檢測支原體、衣原體,均應為陰性;

3.8.5 內毒素檢測:收獲細胞前取少量培養物,回輸前,用鱟試劑檢測內毒素含量,標準:內毒素<0.5 EU/ml。



DC 培養試劑推薦

注:Animal Free 意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產過程中不會有任何動物源性物質,尤其是牛的病原體和蛋白的混入,使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病,克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應,因此細胞治療的體外細胞培養過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。


DC 鑒定試劑推薦

注:用于DC 鑒定的表面標志物的表達在流式圖上均呈現單個峰,且多數情況下不能與陰性峰完全區分開來。為避免多色分析時補償調節不好導致結果的不準確性,建議最好用單標,最多用雙標來做DC 表面標志的分析,而且必須使用同型對照,而非空白細胞對照來排除背景染色。



注意事項

1. DC 的來源

DC 有多種來源,包括外周血單核細胞(Monocyte)、臍帶血CD34+細胞、骨髓和胎肝等,但因外周血單核細胞最容易獲取、數量也最多,所以臨床上被廣泛用作DC 的來

源細胞。


2. DC 的成熟度

DC 有未成熟和成熟兩種狀態,即iDC 和mDC,而DC 的抗原遞呈能力與其成熟狀態密切相關。iDC 的抗原攝取和加工能力較強,但抗原遞呈能力很弱。在體外培養時,iDC 去除細胞因子(即GM-CSF 和IL-4)后,會逆轉為巨噬細胞,且即使在細胞因子的維持下,未成熟DC 的功能也不是激活T 細胞,而是抑制T 細胞的增殖。mDC 則正好相反,其抗原攝取和加工能力很弱,但具有很強的抗原遞呈能力。因而可以激活T 細胞,引起免疫反應。而且DC 成熟后即使在培養體系中去除細胞因子,仍能保持DC 的狀態和功能,不會發生逆轉。因此可以看出,DC 必須完全成熟后才能用于免疫治療。


3. DC 的無牛血清培養

DC 最初都是在含有小牛血清(Fetal Calf Serum,FCS)的培養體系中獲得的,但我們知道,如果想將DC 應用于臨床治療,則不能使用FCS。然而如果不用FCS,DC 則無法培養成功。單核細胞在含10%人自體血漿的培養液中培養,用GM-CSF 和IL-4 誘導7 天后,大多數單核細胞仍貼壁,半懸浮的iDC 數量非常少。后來經過不斷摸索發現,在無血清培養基中添加1%人自體血清對于從單核細胞誘導成為iDC 效果最好。

更為困難的步驟是如何在無牛血清培養體系中將iDC 誘導成為mDC。TNF-a和IL-1b在含牛血清培養體系中均是很好的DC 成熟誘導劑,而在無牛血清培養體系中,兩者均無效或效果微弱,即在無牛血清清培養體系,TNF-a和IL-1b不能將iDC 誘導成為mDC,或僅能誘導一小部分iDC 成為mDC。

后來的研究表明,用單核細胞條件培養基(Monocyte-conditioned medium,MCM),即單核細胞在包被有免疫球蛋白的細菌平皿上無牛血清培養24 小時后得到的培養上清,可在無牛血清培養體系中誘導DC 的完全成熟。因此認為,1%人自體血漿+ MCM 可能成為臨床上獲得成熟DC 的標準方法。但每次制備的MCM 的一致性很難保證,導致每批MCM 必須經過測試后才能確定最適用量,這給臨床應用帶來阻力和不穩定性。所以,人們一直想尋找到能夠替代MCM的化學成分明確的成熟誘導組合。1997 年,德國美因茨大學(Mainz University)的Jonuleit 等取得了突破性進展,他們發現TNF-a,IL-1b和IL-6 三種細胞因子的組合可完全替代MCM,在無牛血清培養體系中能夠將iDC 誘導成完全成熟的DC。


4. PGE2 DC

德國美因茨大學的Jonuleit 在證明TNF-a,IL-1b和IL-6 三種促炎癥因子的組合可完全替代MCM,在無牛血清培養體系中能夠將iDC 完全誘導成熟的同時,也發現另一種炎癥介質,即PGE2 可進一步提高DC 的產量、成熟度、遷移能力和免疫激活能力,也就是說在TNF-a,IL-1b和IL-6 之外添加PGE2 可獲得更為成熟和高效的DC,這樣會提高臨床上DC 的治療效果。PGE2常被加入DC成熟誘導組合中最重要的原因是其可提高成熟DC的遷移能力,這樣可使DC 更容易到達淋巴結,從而引起免疫反應、治療腫瘤。但我們也應該注意以下幾點:

1) PGE2 不能添加到DC 誘導分化的Step 1 中,如加入,DC 的分化將會被抑制;

2) 我們知道,能誘導機體產生Th1 反應的DC (很多文獻中稱為DC1)有助于多種腫瘤,如黑色瘤和惡性膠質瘤等的治療。實驗研究表明,在成熟誘導因子(TNF-a/IL-1b)中加入PGE2 傾向于將iDC 誘導成為成熟的DC2,而非DC1,該DC 會誘導產生Th2 反應。所以很多人在試圖尋找能夠誘導DC1 的最佳成熟誘導組合,如TNF-a/IL-1 b/IFN-a/IFN-g/poly-I:C,TNF-a/IL-1b/IFN-g/PGE2(低濃度)/R848(TLR7/8 激動劑)和IFN-g/LPS 序貫組合等,但這些新組合都未得到臨床上的充分驗證,也就沒有真正用于臨床級別DC的制備。

3) 其實,各家的研究結果不盡相同。比如,TNF-a/IL-1b/IL-6/PGE2 組合的創立者---德國美因茨大學的Jonuleit 在研究時就發現,添加PGE2 誘導成熟的DC 在刺激T 細胞時可顯著提高其分泌的IFN-g產量,而對 IL-4 和IL-10 的分泌無影響,提示添加PGE2 誘導成熟的DC 具有誘導Th1 反應的傾向。

總之,培養體系中是否加入小牛血清,以及所使用的無血清培養基種類不同等諸多因素都可能導致添加PGE2 誘導成熟的DC 在性質上的差異,因此臨床上制備DC 時最好能夠做充分的前期研究,然后確定用于治療某種腫瘤最好的制備方法。


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