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ELISA操作常見問題和解決方法

時間:2015-04-22 作者:市場部 文章來源: 瀏覽:12551


ELISA操作常見問題和解決方法


 

ELISA即酶聯免疫吸附實驗,是目前廣泛應用于各種抗原抗體檢測的方法,主要有靈敏度高和特異性強的特點。ELISA操作步驟看似簡單,整個測定過程中卻有諸多影響因素,導致檢測結果可能與實際結果偏差較大。為幫助大家分析實驗中常見問題,我們將常見問題的可能原因和解決方法歸納總結于下表:

 

問題一:高背景或陰性對照值偏高

能原因

建議

陰性對照孔被陽性對照或樣品污染

洗滌時,勿將洗液溢出孔外

抗體非特異性結合 

封閉液不適合,更換封閉液

酶結合物過濃

請檢查酶結合物是否按說明書規定稀釋

孵育溫度過高

檢查孵育箱的溫度是否正確、穩定

底物在使用前曝光

應保存在暗處,避光

讀板前停留時間過長

加終止液后3分鐘內讀數

 

問題二:陽性對照值偏低或低吸光度

能原因

建議

試劑未平衡至室溫

實驗開始前,將試劑盒從冰箱取出平衡至室溫

檢測體積偏小

檢查移液器吸液管道是否堵塞

孵育時間過短 

使用計時器,準確孵育時間 

底物受污染 

使用新配置的試劑,重新實驗

包裝袋中有濕氣 

檢查袋中是否有干燥劑 

樣本中有抑制劑

疊氮鈉會抑制HRP酶的活性 

 

問題三:邊緣效應

能原因

建議

蒸發 

各步之間,須使用封版膠密封反應板

溫度不均勻 

校準孵育箱,勿疊放反應板


問題四:標準曲線不佳 

可能原因

建議

倍比稀釋標準品時未混勻 

稀釋標準品的每一步均需混勻

過早稀釋

標準品在快要使用時稀釋

加入的體積不正確

使用校準過的移液器,快速、等量的將標準品分配到各個微孔中

 

問題五:標準曲標準曲線良好,但樣本無檢測信號

可能原因

建議

樣本中無檢測物或檢測物含量極低

設置內參,重新實驗

樣本中其他物質影響/掩蓋檢測

作適當稀釋,降低其他物質的干擾,或作系列稀釋,檢測回收率

樣本中檢測物濃度過高,Hook效應導致假低值

適當倍數稀釋樣本,檢測物濃度盡量在試劑盒檢測范圍內

 

問題六:重復性較差

可能原因

建議

微孔中有氣泡

用針尖挑破氣泡

試劑未混勻

確保充分混勻試劑

樣本中有雜質或沉淀物

使用前離心

微孔包被面被吸頭劃破

加液時小心操作

使用用過的封板膠紙

每次須使用新的封板膠封住反應孔

 

問題七:假陽性反應

可能原因

建議

洗滌不充分 

使用前需檢查洗板機是否正常工作

洗板機管道堵塞

需經常維護洗板機 

加結合物時,灑在微孔邊緣 

小心向微孔加入結合物,加入微孔底部中央,避免與孔壁和邊緣接觸 

檢測樣本中含有紅細胞 

離心 

微孔中液體揮發 

用封板膠密封反應孔,置于濕盒內 

 

問題八:整塊板產生陽性OD值或整個板顯藍色

可能原因

建議

洗滌液體積不足或底物被殘留于孔底的結合物所污染 

洗滌時,緩沖液充滿至孔邊緣,但要確保不能溢出孔外

結合物濃度過高

檢查是否按照說明書推薦比例稀釋 

血清中有血清因子 

勿加熱血清 

底物容器不潔凈 

用酸清洗容器瓶,用蒸餾水沖洗

底物孵育時,微孔板曝光 

加底物時,立即將板置于暗處


問題九:整塊板OD值偏低

可能原因

建議

顯色時間不足 

適當延長顯色時間 

孵育溫度偏低 

36度為最適反應溫度(欣博盛ELISA試劑盒) 

未加終止液 

加入終止液,增強顏色反應的強度,穩定最終的顏色反應 

 

問題十:顯色緩慢

可能原因

建議

樣本未置于室溫 

實驗開始前,將樣本平衡至室溫 

酶結合物活性減弱 

檢測稀釋度 

酶活性收到抑制如疊氮鈉 

避免實驗不當的防腐劑 

顯色溫度不適當 

按說明書操作

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